|
Основные методы инженерии были разработаны вначале 70-х гг. Суть этих методов - введение в организм нового гена. Такой ген может быть синтезирован заново, а может быть перенесен из другого организма. Если в геном бактерии встроить ген, кодирующий какой-либо белок, бактериальная клетка превращается в живую фабрику по производству этого белка. В качестве примера рассмотрим перенос в клетку и генов, кодирующих инсулин человека и гормон роста человека.
Получить копию любого гена в настоящее время задача совсем нетрудная. В некоторых заведениях для этого требуется всего одна исходная копия. Получение множества идентичных копий называют клонированием. В качестве клонирующего вектора (т.е. переносчика ДНК, которую нужно клонировать) традиционно используют плазмиды или бактериофаги. Плазмиды – это небольшие кольцевые фрагменты ДНК, обнаруженные в некоторых бактериях. Они отделены от основной (хромосомной) ДНК, и могут реплицироваться независимо от нее. Бактериофаги (или, для краткости, фаги)- это вирусы, которые могут вводить свою ДНК в бактериальную клетку, эта ДНК реплицируется. Фрагменты ДНК, которые необходимо клонировать, соединяют либо с плазмидной, либо с фаговой ДНК. Полученная «конструкция», состоящая из ДНК-фрагментов различных организмов, называется рекомбинантной ДНК. Если такую ДНК ввести в бактериальную клетку, то с каждым циклом деления увеличивается и число копий рекомбинантной ДНК. Встроенный в бактериальный геном чужеродный ген может использоваться для получения в промышленных количествах полезного белка, например такого, как инсулин человека, который в норме не производится бактериальной клеткой.
Генную инженерию бактерий можно подразделить на пять этапов.
Этап 1. Выделение копии нужного гена из всех остальных генов организма.
Этап 2. Встраивание нужного гена в вектор.
Этап 3. Использование вектора для введения нужного гена в репициентную клетку.
Этап 4. Отбор клеток, в которые вошла чужеродная ДНК (донорная ДНК).
Этап 5. Клонирование гена
Приведенная выше очередность этапов - самая простая. Однако в некоторых случаях порядок действий может быть иным; например, в вектор может быть встроена и клонирована целая группа генов и лишь затем выделен нужный ген.
Этап 1. Получение копии нужного гена.
Это самая трудная часть процесса. Например, в геноме человека (геном это вся ДНК в клетке) насчитывается около 3млрд. нулеотидов и ≈ 100 000 генов. Типичный ген имеет несколько тысяч пар нуклеотидов в длину, так что даже найти конкрентный ген не так просто. Для получения копии гена используют три метода:
1) С помощью обратной траскриптазы получат копию гена на матрице его мРНК;
2) Синтезируют искусственный ген.
3) Используют метод «дробовика» («shotgun»), вклющающий разрезание ДНК рестрикционными ферментами (рестриктазами)и поиск фрагмента, содержащего нужный ген.
Метод «дробовика» - использование рестрикционных ферментов.
Этот первый метод выделения генов был разработан в конце 1960-х начале 1970-х гг. его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикционными (от англ. Restricting- ограничивающий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрекционные эндонулеазы. Кажда из них разрезает нуклеоновую кислоту (отсюда «нуклеаза») в строго определенных точках («эндо» означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействий именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отношении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы.
Название каждого фермента происходит от названия бактерии, из которой его выделяют. Рестрицируемая последовательность - мишень часто имеет шесть оснований в длину и является палиндромной, т.е. читается одинаково в обоих направлениях. Две комплементарные цепи ДНК считываются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы производят ступенчатые надрезы. В результате их действия образуются фрагменты ДНК с выступающими одноцепочечными концами. Такие концы называются «липкими»; их используют для воссоединения фрагментов ДНК. Они как бы слипаются за счет образования водородных связей с комплементарными липкими концами других молекул ДНК, разрезанных той же рестриктазой.
При обработке ДНК донорного организма рестриктазами рассчитывают на то, что один из фрагментов будет случайным образом содержать полную копию нужного гена и ничего больше.
Этап 2. Встраивание генов в вектор
Плазмидная ДНК
Кольцевые молекулы плазмидной ДНК у бактерий гораздо меньше, чем основная хромосомная ДНК, поэтому их можно легко отделить друг от друга. Бактериальные клетки разрушают и центрифугируют. При этом хромосомная ДНК оказывается в осадке, а плазмидная ДНК остается в жидкой фазе над осадком. Перед обработкой рестриктазами плазмидную ДНК очищают.
|
