ПЦР-реакция

От экспериментатора требуется только правильно составить рабочую смесь. Разумеется, если праймеры уже выбраны и синтезированы в достаточном количестве. Taq ДНК-полимераза и нуклеозидтрифосфаты имеются в продаже. Наработку большого количества определенного гена при помощи ПЦР-реакции часто называют «клонированном» этого гена. Описанную здесь ПЦР-реакцию с двумя праймерами иногда именуют «симметричной», в отличие от другой тоже ПЦР-реакции, но с одним начальным праймером, которую называют «ассиметричной».

ПЦР-реакцию надо включить в описанную там последовательность операций между получением кДНК и включением ДНК в плазмиду. В этом случае последовательность 21-го нуклео-тида для праймеров придется выбирать не свободно, а точно по концам гена, кодирующего наш белок. Эти оба конца можно установить, как это было описано с помощью ЧИП-метода. Для этого даже не надо знать всю аминокислотную последовательность белка, а только концевые участки — по 7 аминокислот с каждого конца. (Благо, как упоминалось, секвенирование белка теперь можно начинать с любого конца.) При синтезе концевого праймера надо только добавить концевой кодон УГА, который не транскрибируется в иРНК. Кроме того к «наружным» концам обоих праймеров имеет смысл уже на этом этапе добавить небольшие последовательности нуклеотидов, которые, не будучи комплементарны ни к какому участку гена, не будут и гибридизоваться. Но могут образовать два «липких» конца для последующего включения размноженной кДНК в разрезанные плазмиды. На рис. 35 эти дополнительные последовательности изображены в виде «хвостиков» у праймеров. Напомню, что эта размноженная кДНК нам потребовалась для того, чтобы добиться достаточно эффективного включения содержащих ее плазмид в бактерию, которая, размножаясь, будет нарабатывать в большом количестве нужный нам белок.

Весь полный комплекс мер по умножению количества индивидуального белка иной раз оказывается столь эффективным, что чужеродный белок в цитоплазме бактерий-рециплиентов появляется в ходе их размножения в виде гранул. Он ведь чужой — и потому не расходуется в самой бактерии. После лизиса клеток гранулы можно собрать простым центрифугированием. Для их диссоциации приходится использовать обработку осадка щелочью, детергентами и мочевиной. Белок денатурируется. Для его ренатурации приходится прибегать к разбавлению, диализу от денатурирующих добавок, изменению рН и ионной силы среды.

Подлинность наработанного белка проверяют по ферментативной активности, если он должен таковой обладать. Или же по электрофорезу — сравнением с контрольным препаратом. Но надежнее — одним из иммунологических методов контроля, с которыми мы познакомимся в свое время.