Электрофорез белков (общие положения)

Вернемся теперь к белкам в электрофорезе. Мы их вносили в трубочку, очевидно, уже растворенными в выбранном для них буфере. Раствор этот был более или менее разбавленным. В ходе электрофореза белки, как мы увидим ниже, будут собираться в узкие зоны, где концентрация каждого из них окажется гораздо выше чем изначально. Вот там-то емкости буфера может не хватить, рН раствора может измениться. За ним изменится и суммарный заряд белка, а следовательно и скорость миграции белковой зоны. Устранить эту опасность, на первый взгляд, легко. Достаточно в несколько раз увеличить концентрацию буфера. Но это будет означать, к примеру для Трис-НСl буфера, такое же увеличение концентрации ионов С1-. А значит и увеличение силы тока и, как следствие, усиление разогрева жидкости в трубочке. В результате чего возникнут искажения картины разделения белков. Хотя бы потому, что температура жидкости в центре трубочки будет выше, чем у ее стенок. Но ведь можно уменьшить напряжение на клеммах источника. Но это приведет к падению напряженности поля и соответствующему замедлению миграции белков. Что нежелательно ввиду диффузного размытия областей (полос) миграции. В порядке компромисса выбирают обычно молярность буфера в пределах 0,1-0,2М.

Нежелательная ситуация может легко возникнуть и в том случае, когда рН рабочего буфера выбрана близ границы буферной области (см. гл. 2, § 1). Здесь буферная емкость мала по определению. И потому вышеописанный эффект изменения рН в зоне концентрации белка может быть особенно опасен.

Вполне возможно, что столкнувшись с такими трудностями экспериментатору придется отказаться от первоначально выбранного буфера и заменить его на другой, с менее подвижными ионами.

Я не собираюсь приводить здесь практические рецепты. Мне только хотелось показать, что выбор буфера для электрофореза дело тонкое, требующее вдумчивой оценки данной конкретной ситуации.

Теперь обратимся к другой стороне проблемы. До сих пор мы рассматривали только равновесие электрических сил, действующих на белки и сил трения в жидкости. Размер частиц в этом случае может сказываться двояко. С одной стороны будет увеличиваться сила трения в водной среде, но, с другой стороны, может увеличиться и суммарный электрический заряд на поверхности белковой глобулы. Попробуем различие размеров разных белков использовать более определенным образом. Для этого создадим помимо трения о жидкость еще и дополнительное трение — напрямую связанное с размерами мигрирующих молекул белка. Создадим искусственные преграды для миграции в виде пространственной сетки, ячейки которой будут соизмеримы с размерами белков. Эта сетка должна быть образована волокнами, которые надежно смачивает вода, коль скоро мы будем работать в водных растворах. В этом случае буфер будет заполнять ячейки сетки целиком. Хорошо бы, чтобы в нашем распоряжении была возможность выбирать размеры ячеек или пор этой сетки — в зависимости от диапазона размеров белков, которые мы собираемся разделять. Очевидно, что все молекулы белков должны иметь возможность проходить через поры, ни в коем случае не застревать в них. Но проходя, они должны постоянно сталкиваться с образующими поры нитями, что будет тормозить их миграцию в электрическом поле. И чем крупнее белки, тем чаще им придется испытывать эти столкновения, тем «труднее« и медленнее они будут мигрировать. Самые мелкие белки, напротив, будут проходить через поры едва касаясь их нитей. Скорость миграции для белков различной величины, опять-таки, установится постоянной, поскольку статистически постоянным будет эффект столкновения с нитями — он зависит только от соотношения размеров молекул белка и пор. Мы получаем мощное средство разделения белков по их размерам.