|
Как только прекращается действие электрического поля, разделившиеся белковые зоны склонны «расплываться» в силу тепловой диффузии. Поэтому сразу после окончания разделения белки необходимо фиксировать в тех местах геля, куда они успели дойти. Проще всего это сделать осаждением из раствора прямо в геле. Пористость полиакриламидного геля позволяет легко изменять жидкую среду, окружающую белки, путем простого вымачивания извлеченной из формы пластинки геля в соответствующем водном растворе. Для фиксации осаждением пригодны крепкие растворы уксусной кислоты (СНзСООН) или ТХУ — трихлоруксусной кислоты. Последнюю используют в виде 10% -ного или 50% -ного раствора.
Часто фиксацию белков совмещают с их окрашиванием. Для этого краситель растворяют в ТХУ или в смеси уксусной кислоты с метанолом.
Исторически для окрашивания белков в геле были прежде всего использованы давно апробированные красители для шерсти. Это — сложные молекулы с несколькими ароматическими кольцами и заряженными группами. Механизм их взаимодействия с белками еще далеко не ясен. По-видимому, первоначальное связывание идет за счет кулоновского взаимодействия отрицательно заряженных сульфогрупп с положительно заряженными боковыми группами основных аминокислот белка. Буфер в момент окрашивания заменяется на сильно кислую среду. В ней преимущественный заряд любого белка становится положительным. В то же время краситель, несущий «сильную» SОз-группу сохраняет отрицательный заряд даже при малых значениях рН. Далее связь белка с красителем закрепляется водородными и гидрофобными связями. Для кислых белков широко используют красители класса «Кумасси яркоголубой» (Coomassie brilliant blue). Его выпускают в двух модификациях СВВ R-250 и СВВ G-250. Обилие ароматических колец в красителях этого типа делает их плохо растворимыми не только в воде и разбавленной уксусной кислоте, но даже и в 10% -ной ТХУ. В этих случаях для улучшения растворимости добавляют до 40% метанола. Если используют 50%-ную ТХУ, то в этом нет необходимости. Содержание красителя в растворе 0,1-0,25% по весу. Продолжительность окрашивания варьирует в зависимости от толщины геля в пределах от 3 до 12 часов. Для ускорения проникновения раствора в гель окрашивание можно вести при температуре 37°.
Первоначально после окончания процедуры окрашенным кажется весь гель. Но молекулы красителя не связываются акриламидом. После окончания окраски сам гель можно отмыть до полной прозрачности, вымачивая его в течение ночи в достаточно большом объеме 7%-ной уксусной кислоты. Чувствительность метода позволяет вполне надежно обнаружить полоску, содержащую 10 мкг белка.
До сих пор речь шла о кислых белках. Основные белки окрашиваются теми же красителями еще проще, так как они уже несут положительный заряд. Достаточно позаботиться о растворимости красителя и осаждении белка.
На порядок величины лучшую чувствительность дает окрашивание белков ионами серебра. После осаждения белков уксусной кислотой и этанолом, тщательной промывки этанолом и водой гель переносят на 30 минут в 5 объемов 0,1% раствора AgNO3.
Затем после промывки водой в такой же объем карбоната натрия + 0,02% формальдегида (НСНО). Инкубируют при комнатной температуре, покачивая кювету. Окрашенные полосы белка появляются через несколько минут. Следует дождаться наилучшего контраста и остановить реакцию промывкой в 1%-ной уксусной кислоте. Механизм окрашивания неясен. Но, по-видимому, он в чем-то сходен с восстановлением серебра в фотографическом процессе. Во всяком случае при проявлении окраски белков следует точно так же избегать передержки в проявителе.
|
