|
Ферменты рестрикции стали эффективным инструментом исследования. Они позволяют превращать молекулы ДНК очень большого размера в набор фрагментов длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч оснований. С помощью метода электрофореза в агарозном геле (см. раздел 1) фрагменты ДНК, различающиеся по размеру, можно легко разделить, а затем исследовать каждый фрагмент отдельно.
Короткие фрагменты мигрируют намного быстрее, чем длинные. При сравнительно высокой концентрации агарозы большие фрагменты вообще не могут проникнуть в гель. В процессе миграции рестрикционные фрагменты не деградируют, их можно элюировать (вымывать) в виде биологически активных двуцепочечных молекул. При окрашивании гелей красителями, связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых отвечает рестрикционному фрагменту, молекулярную массу которого можно определить, проведя калибровку с помощью ДНК с известными молекулярными массами.
Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного участка генома набором рестрицирующих нуклеаз позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано положение каждого сайта рестрикции относительно других участков.
Молекулу ДНК длиной 5000 пар нуклеотидов (п. н.). обрабатывают отдельно рестриктазами А и В. Фрагменты разделяют электрофорезом. Фермент А разрезал ДНК на 4 фрагмента размером 2100, 1400, 1000 и 500 п. н. Обработка рестриктазой В дала 3 фрагмента: 2500, 1300 и 1200 п. н. (рис. 37). Для определения расположения сайтов рестрикции этих ферментов на следующем этапе применяют процедуру двойного расщепления – обрабатывают ДНК двумя эндонуклеазами. Обработка изучаемого фрагмента одновременно двумя рестриктазами дала 6 фрагментов: 1900, 1000, 800, 600, 500, 200 п. н.
Рис. 1. Результаты электрофореза после обработки фрагмента ДНК разными рестриктазами
Наиболее полный вариант – элюировать каждый фрагмент, образующийся в результате расщепления одной рестриктазой, а затем обработать его второй. Смесь фрагментов, полученных после такой обработки, также анализируют с помощью электрофореза. В нашем примере были получены следующие результаты:
Обработка каждого из 4-х А-фрагментов рестриктазой В
2100 - 1900 и 200,
1400 - 800 и 600,
1000 - 1000 (изменений нет)
500 - 500 (изменений нет)
Обработка каждого из 3-х В-фрагментов рестриктазой А
2500 - 1900 и 600
1300 - 800 и 500
1200 - 1000 и 200
Анализ полученных результатов показывает, что каждый из ферментов, полученный при расщеплении А-фрагментов рестриктазой В можно обнаружить в образцах, полученных при расщеплении В-фрагментов рестриктазой А. Ключом к рестрикционному картированию являются перекрывающиеся фрагменты. Такими в рассматриваемом примере являются В-фрагмент 2100 и А-фрагмент 2500. При обработке другой рестриктазой они дают фрагмент 1900.
Из данных о расщеплении этих фрагментов мы предполагаем, что с одной стороны на расстоянии 200 п. н. от фрагмента 1900 находится следующий А-сайт, а с другого конца, на расстоянии 600 п. н. – следующий В-сайт (рис. 38). При обработке двумя эндонуклеазами фрагмент 200 п. н. образуется 1 раз, при обработке рестриктазой А из В-фрагмента 1200, т. е. фрагмент 1200 лежит слева. Остается определить, как продолжается карта вправо. Очевидно, это А-фрагмент 1400, так как он рассечен рестриктазой В на фрагменты 600 и 800. Вправо от фрагмента 2500 следует отложить, очевидно, фрагмент 1300. Тогда логично наличие А-фрагмента 500 и деления В-фрагмента 1300 рестриктазой А на 800 и 500.
|
