|
При одномерной хроматографии 1 мл полученной вытяжки наносят полосой длиной 12 см на расстоянии 2 см от нижнего края листа. Нанесли 1,4 мл образца.
Разделение пигментов на одномерной хроматограмме
На одномерной хроматограмме в зависимости от применяемой для разгонки смеси растворителей удается отделить каротин, ксантофиллы и хлорофилл а и в.
Хроматограмму помещают в камеру, заполненную 30 мл смеси, состоящей из бензола и петролейного эфира (2:1). Через 30-40 минут, когда фронт растворителя поднимется на 14 см и будет видно четкое разделение пигментов, хроматограмму вынимают и подсушивают. Самую верхнюю полосу образует каротин, ниже него лежит хлорофилл а, под ним распологаются ксантофиллы, а самый последний – хлорофилл в.
Окрашенные полосы, соответствующие пигментам вырезают, измельчают и переносят в отдельные бюксы на 25 мл. Каротин эллюируется хлороформом, ксантофиллы и хлорофиллы – смесью спирта с ацетоном (1:3).
Растворитель добавляют небольшими порциями, каждый раз настаивая 2-3 минуты.
Эллюция пигментов с бумажного носителя
Эллюцию проводят до полного обесцвечивания бумаги. Элюат фильтруется через стеклянный фильтр или центрифугируется для удаления взвешенных частиц бумаги. Экстракт аккуратно сливают в мерные пробирки и доводят до 5-10 мл в зависимости от интенсивности окрашивания. Полученные экстракты используют для фотоколориметрии с использованием калибровочной кривой, построенной для определенного прибора.
Для получения калибровочных кривых использовали два раствора – раствор Гетри (для зеленых пигментов) и двухромовокислый калий (для желтых пигментов).
Определение оптической плотности пигментов
Оптическую плотность элюата определяют на фотоэлектроколориметре, за синим светофильтром для желтых пигментов и красным для зеленых. Желательно работать в средней области шкалы, где относительная ошибка прибора минимальна.
Оптическая плотность элюата |
Д |
Хлорофилл а |
Хлорофилл в |
каротин | |
0,015 |
0,01 |
0,025 |
Перед тем, как рассчитать содержание пигментов, была построена калибровочная кривая. Использовали раствор известной концентрации 1% CuSO4*5H2O – 25,5 мл; 2%К2Сr2O7 – 50 мл; 7% - NН4ОН (100мл раствора).
Желтые пигменты |
разведение |
Д | |
1:0 |
0,745 | |
1:1 |
0,35 | |
1:2 |
0,274 | |
1:3 |
0,235 | |
1:4 |
0,19 | |
1:5 |
0,165 | |
1:6 |
0,133 |
Зеленые пигменты |
разведение |
Д | |
1:0 |
0,38 | |
1:1 |
0,18 | |
1:2 |
0,12 | |
1:3 |
0,1 | |
1:4 |
0,095 | |
1:5 |
0,08 | |
1:6 |
0,065 |
После измерения оптической плотности был построен калибровочный график.
Эквиваленты:
Хлорофилл а – 23,3 мг
Хлорофилл в – 31,5 мг
Каротин – 2,35мг
Виолоксантин – 2,7 мг
По калибровочному графику с помощью оптической плотности элюата нашли концентрации хлорофиллов и каротиноидов. (рис1)
Затем рассчитали содержание пигментов по формуле
Х= (С1*Vэл*Vэк)Vн*Р,
где С1- концентрация пигмента в элюате, определенная по калибровочному графику согласно оптической плотности;
Vэл – объем элюта, мл; Vэк – объем экстракта из навески, мл; Vн – объем раствора, нанесенного на бумагу, мл; Р – навеска в г.
Перейти на страницу: 1 2 3 |
